El programa de Biología del convenio CES –EIA  e integrantes del Centro de Investigación e Innovación de Excelencia en Biodiversidad y Biotecnología de Antioquia – Biointropic,   presta los servicios descritos a continuación a la industria de la ciudad y del país.


Evaluación biológica de los productos sanitarios:

Con el auge de la industria de los biomateriales y la tendencia hacia la estandarización global de los sistemas de medida de riesgo al consumidor, es necesario hacer una batería de pruebas para evaluar su seguridad y satisfacer los requerimientos de los mercados mundiales.

La Norma ISO 10993 es una combinación/armonización de numerosas normas y directrices nacionales e internacionales relativas a la evaluación biológica de productos sanitarios. Es un documento destinado a servir de guía para la selección de ensayos que permitan la evaluación de las respuestas biológicas con respecto  la seguridad de los productos sanitarios y de los materiales.

El papel de esta parte de la Norma ISO 10993, es el de servir como referencia para la planificación de dicha evaluación biológica, reduciendo al mínimo el número y la exposición de los animales de ensayo.

El objetivo principal de la norma es la protección de las persona. La selección y la interpretación apropiada de los ensayos de evaluación biológica exigen una clara comprensión de la razón fundamental de los ensayos. A continuación mostramos un diagrama de flujo para facilitar el enfoque sistemático a la evaluación biológica de los productos sanitarios (figura 1).

Figura 1. Diagrama de flujo del enfoque sistémico sobre la evaluación biológica de productos sanitarios

Dentro de las pruebas toxicológicas mas utilizadas para evaluar un nuevo producto se destacan, las pruebas de citotoxicidad y genotoxicidad.


EVALUACIONES BIOLÓGICAS DE TOXICIDAD

PRUEBAS DE CITOTOXICIDAD
Las pruebas de citotoxicidad son utilizadas para determinar la proporción de células que mueren después de un proceso como la exposición a un fármaco o un nuevo biomaterial.

Exclusión de colorante vital
Esta prueba establece la proporción de células que tienen una membrana plasmática intacta y es determinada por las células que interiorizan un colorante (azul de tripano) el cual bajo condiciones normales es impermeable. Esta prueba es altamente realizada por su rapidez, pero tiene la desventaja que no permite evaluar la capacidad proliferativa de la célula y tiende a sobre-estimar la viabilidad celular.

Prueba de MTT:
Esta técnica permite medir la reducción de sales de tetrazolium solubles en agua, a un formazan pigmentado. Entre estas sales la MTT es la sal más utilizada en la literatura asociada a los ensayos en biomateriales y es reducida por células vivas activas metabolitamente desde un color amarillo a azul de formazán, un pigmento insoluble en agua que es cuantificado  por espectrofotometría a una longitud de onda de 540-570 nm. La reducción del pigmento históricamente ha sido asociada a la actividad de las enzimas mitocondriales y de la cadena transportadora de electrones, sin embargo algunos hallazgos muestran que la reducción también podría ser catalizada por enzimas no mitocondriales presentes en el citosol, el retículo endoplasmático y la membrana plasmática  .

Se han reportado aplicaciones de las pruebas de citotoxicidad a diversos biomateriales, entre los que se destacan materiales de impresión de hidrocoloide irreversible,  acero inoxidable,   polietereterketona,   cementos de fosfato tricalcico   dopados con Zn  , hidrogeles  , recubrimientos vítreos  , recubrimientos de HA   , hidróxido de calcio y primers  , aleaciones de titanio como TiMo12Zr6Fe2 , y amalgamas dentales basados en Gallium  .  Los resultados muestran diferentes grados de toxicidad asociados a la presentación del material, al tipo de célula utilizada y al tiempo de exposición.

Entre las ventajas mas importantes de esta prueba se destaca que además de determinar el número de células que murieron después de la exposición a un compuesto nos permite determinar entre las células que están vivas sin capacidad de proliferar y aquellas que están vivas y con capacidad de proliferar.


PRUEBAS DE GENOTOXICIDAD
Para hacer la evaluación genotóxica de una sustancia se han utilizado una amplia gama de pruebas que miden diferentes daños producidos en el ADN, dentro de estas pruebas se encuentran las pruebas citogenéticas como la cuantificación de berraciones Cromosómicas (AC) e Intercambio de Cromátides Hermanas (ICH) que han sido fuente de referencia por su alto grado de resolución, las pruebas de clastogenicidad  que permiten hacer una evaluación de las rupturas de la cadena de ADN de una manera rápida con alto grado de sensibilidad como la técnica electroforesis en gel de células individuales (Ensayo cometa), las técnicas de mutagenicidad que permiten determinar la alteración genética a través de la funcionalidad de algunos productos genicos específicos como la técnica de HGPRT. Todas ellas


Aberraciones cromosómicas:
Esta prueba como su nombre lo dice, nos permite evaluar los cambios numéricos y estructurales que puedan suceder en los cromosomas después de exponer las células a un proceso traumático (exposición a un fármaco o biomaterial). En esta prueba se determinan las aberraciones primarias, las cuales se pueden definir como aquellas que aparecen en la primera metafase después de la exposición a una sustancia y no vuelven a aparecer en las siguientes metafases, ya que influyen en el proceso de división y son letales a la célula, y las aberraciones secundarias, las cuales se pueden definir como aquellas que no afectan la división celular y pueden ser transmitidas a una segunda generación.

Esta prueba es considerada como “prueba de oro” en la evaluación de la genotoxicidad de un compuesto, por su alta precisión y confiabilidad, pero tiene la desventaja de ser demorada.


Intercambio de Cromátides Hermanas (ICH):
Los ICHs se originan de manera normal en células de mamíferos en estado replicativo     y se han utilizado ampliamente como un indicador sensible de genotoxicidad. En teoría, el análisis del ICH se puede realizar en cualquier línea celular que pueda replicarse en cultivo y tienen como único requisito que la célula pueda incorporar bromodeoxiuridina (BrdU) (un análogo de timidina) hasta un segundo ciclo celular.

La técnica de Intercambio de Cromátides Hermanas se ha utilizado para evaluar el efecto de exposición ocupacional  ,  innumerables medicamentos   y mas recientemente la biocompatibilidad de algunos biomateriales    .


Electroforesis en gel de células individuales (ensayo cometa):
El ensayo cometa es una técnica particularmente valiosa y permite la detección de diferencias intercelulares en el daño de ADN y reparación en cualquier población celular eucariótica que puede ser obtenido como una suspensión celular de 100.000 células. El resultado se puede obtener en un solo día, además el costo es extremadamente bajo en comparación de otras técnicas para la evaluación de genotoxicidad. La sensibilidad de la prueba se ha demostrado ampliamente    ya que se ha detectado hasta 0.1 quiebres de ADN  por 109 dalton  . Esto la convierte en una herramienta de gran utilidad para la investigación de la genotoxicidad de biomateriales


Prueba de mutagenicidad HGPRT:
En esta prueba, el cultivo celular se trata durante un periodo de 6, 12 y 24 horas con el extracto liberado por los biomateriales y se seleccionan  las células mutantes en la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT) la cual actúa en la ruta de salvamento de purinas. Esta enzima cataliza la fosforribosilación de la hipoxantina y la guanina transfiriendo el grupo fosforribosil del fosforribosil pirofosfato (PRPP) sobre el nitrógeno 9 en la base de purinas, resultando en la formación de inosina monofosfato (IMP) y guanosina monofosfato (GMP).

Esta prueba ha sido ampliamente usada para evaluar el efecto mutagénico de extractos vegetales , algunos biomateriales como el PEEK,  kevlar  y algunos metales,  perfilándose como una prueba de alta sensibilidad para evaluar potenciales efectos mutagénicos en células de mamífero.